分光光度的概述
吸光光度法定义:
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括紫外可见分光光度法及红外光谱法等。
紫外可见分光光度法所用的光谱区域为200~780nm，其中紫外分光光度法为200~400nm，可见分光光度法为400~ 780nm。
红外光谱法为2.5~1000um。
分光光度法概述
分光光度法的发展历程:
最初人们发现很多物质都具有颜色，例如Mn04-为紫红色，Fe3+为黄色，当含有这些物质的溶液浓度改变时，溶液颜色的深浅度也就随着改变。溶液越浓颜色越深，溶液越稀颜色越浅，因此利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量，这种方法称为“目视比色法”，随后人们又认识到溶液的颜色是由于对光的选择性吸收而产生的，可以利用滤光片和光电池客观的测量溶液的浓度，从而出现了“光电比色法”。随着近代测试仪器的发展，用分光光度计代替比色计，出现了分光光度法。
分光光度法基本原理
溶液颜色与光吸收的关系日常所见的白光，如日光、白炽灯光，都是混合光，即它们是由波长400~780nm的电磁波按适当强度比例混合而成的，这段波长范围的光是人们视觉可觉察到的，所以称为可见光。当电磁波的波长小于400nm时称为紫外光，大于780nm的称为红外光，都是人们视觉觉察不到的光。互补色光:当将某两种颜色的光按适当强度比例混合时，可以形成白光，这两种色光就称为互补色光。
当一束白光(混合光)通过某溶液时，如果该溶液对可见光区各种波长的光都没有吸收，即入射光全部通过溶液，则溶液呈无色透明状。
当该溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，则该溶液呈黑色。
如某溶液对可见光区某种波长的光选择性地吸收，则该溶液即呈现出被吸收波长光的互补色光的颜色。
例如当一束白光通过KMnO4溶液时，该溶液选择性的吸收了绿色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过去，只剩下紫色光未被互补，所以KMnO4溶液呈现紫色。
分光光度计操作注意事项及维护
注意事项:
(1) 每台仪器所配置的比色池不能与其他仪器上的比色池单个调换。
(2) 如果大幅度改变测试波长时，需数分钟才能正常工作。
(3)不测量时不要开光源灯。
仪器维护:
(1) 仪器使用完毕后，用随机提供的套子罩住，在套子内应放数袋硅胶，以免灯室受潮。
(2)经常注意防潮硅胶是否变色，如发现硅胶颜色变红，应将其取出调换或
烘干至蓝色，待冷却后再置入。
(3)拿取吸收池时，绝不可触及光学窗面使用完毕后，应立即清洗，洗涤时只能涮洗、冲洗、浸泡，绝不能刷洗!洗净的吸收池易先倒置于干净的吸水纸(如滤纸)上，待吸干、控净残留水后，再放回比色池的盒子内。如吸收池光学窗面上沾附有水珠，只允许用镜头纸轻轻擦干。
(4)仪器工作数月后，要校正一下波长，用镨钕滤光片校正。
(5)调换光源灯时，带上手套，以防玷污灯的玻璃壳。
721型分光光度计波长的检测与校正(镨汝滤光片法)
1、在比色槽的光路上放一张小白纸，调节波长至580nm。
2、旋动光量T100%的旋钮至最大，在小白纸上应看到桔黄色的光斑
3、若光斑不是橘黄色，左右旋转波长调节旋钮使之出现橘黄色的光斑，粗略判断波长偏离的程度，选择检测的起始波长。
4、调节波长至520nm，用蒸馏水或空气调T“0”和T“100%”。
5、将镨汝滤光片推入光路中，记录T或A值，退出镨汝滤光片。
6、调节波长至522nm, 用蒸馏水或空气调T“0”和T“100%”
7、再将镨汝滤光片推入光路中，记录T或A值，退出镨汝滤光片。
8、如此反复测定直至T值为最小或A值为最大，记录此点的指示波长。
9、将指示波长减去镨汝滤光片吸收波长(529nm)， 即得被校仪器的波长误差。
10、如波长精度超出允许误差60-600nm≤+3nm; 600 700≤+5nm; 700-800≤+8nm)，打开分光光度计左侧调节窗口盖板，用螺丝刀试调波长的调节杆。
11、试调波长的调节杆后，再按步骤3-8操作，直至分光光度计的波长精度误差在其允许范围内即可。
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光吸收曲线
光吸收曲线:将不同波长的光依次通过某一定浓度和一定厚度的溶液，分别测出它对各种波长光的吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制成的曲线(亦称吸收光谱)最大吸收波长(Aμaξ) :在吸收曲线上吸收峰最大处所对应的波长。
标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的标准溶液，在一定条件下显色，使用同样厚度的吸收池，测定吸光度，上然后以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一条直线，在同样条件下测出试样溶液的吸光度就可以从工作曲线上查出试样溶液的浓度。但在实际工作中经常发现标准曲线不成直线的情况，特别是当吸光物质的浓度高时，明显的向上或向下偏离标准曲线，这种情况称为偏离朗伯-比耳定律现象。
引起偏离朗伯-比尔定律的原因
(1)入射光为非单色光。严格讲朗伯-比耳定律只适用于单色光。应选用Aμaξ处或肩峰处测定。
(2)溶液中的化学反应。离解、络合、缔合会破坏线性关系，应控制条件(酸度、浓度、介质等)。
(3)比耳定律的局限性引起偏离。严格说，比耳定律是一个有限定律，它只适用于浓度小于0.01mol/L的稀溶液。
定量分析一溶液浓度的测定
1、工作曲线法(标准曲线)
y=a+bx
式中:x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度
一般来说:透光度在20%~65%或吸光度值在0. 2~0. 7之间时,测定误差相对较小。
2、对比法(直接比较法)
对比法实际相当于工作曲线法的一个特例。y=bx实际就是只配制一个标准溶液，其中待测组分的浓度与试液尽量相近，选用最大吸收波长，在相同条件下依次测定二者的吸光度，按下式直接计算试液中待测组分的浓度。
c样=(A样/A标)×c标
需注意:标准样品和待测样品浓度应接近，且标准样品的吸光度在0.4-0.8以内较好。在只测一、二个样品，且含量大致已知时很方便。
分光光度计基本部件:
光源:
发出所需波长范围内的连续光谱。钨灯(320~2500nm): 可见光区氢灯、氘灯(180~375nm) :紫外区氙灯(180~1000nm) :紫外、可见光区。
吸收池(比色皿、比色杯、比色池) :用于盛待测及参比溶液。
玻璃吸收池(370~3200nm) :可见光区
石英吸收池(185~4000nm) :紫外光区、可见光区
选用比色皿应该考虑的主要因素
(1)测定波长。比色液吸收波长在370nm以上时可选用玻璃或石英，在370nm以下时必须使用石英比色皿。
(2)光程。比色皿有不同光程长度，通常多用10.0mm的比色皿，选择比色皿的光程长度应视所测溶液的吸光度而定，以使其吸光度在0.1~0.7之间为宜。
吸收池的清洗
分光光度测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。根据污染情况，可以用冷的或温热的(40-50°C)阴离子表面活性剂的碳酸钠溶液(%2) 浸泡，可加热10min左右。也可用(1+3) 硝酸溶液浸泡，注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。对于有色物质的污染可用HCL (3moL/L)-乙醇(1+1)溶液洗涤，如急用，可用乙醇、乙醚润洗后用吹风机吹干。
光度测定前可用柔软的棉织物或擦镜纸吸去光学窗面的液珠，将擦镜纸折叠为四层轻轻擦拭至透明。
分光光度计实验室具备条件
(1)仪器室
室温宜保持在15~28℃。相对湿度宜控制在45%~65%，不要超过70%。
防尘、防震和防电磁干扰。仪器周围不应有强电磁场，应远离电场及发生高频波的电器设备。
防腐蚀。应防止腐蚀性气体，如S02、N02及酸雾等侵蚀仪器部件。应与化学操作室隔开。当测量具有挥发性或腐蚀性样品溶液时，吸收池应加盖。
防日光照射。
(2)电源、光源
仪器的工作电源要求一般为220V土20V。如供电电压波动较大，最好配置稳压器。
721型分光光度计的操作步骤及注意事项
操作步骤:接通电源→选择波长→粗调透光度T“0”(开盖)和透光度T“100%”(关盖)→预温20min→放入被测液→精确调节透光度T“0”(开盖)和透光度T“100%”(关盖)→测定， 读取各管吸光度→收场(关电源、罩仪器罩、登记、清洗比色杯等)注意事项:比色时，手拿比色杯的毛面，液体倒杯高的2/3或4/5，比色杯不能用硬毛刷刷洗，也不能用高温烘烤。
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