食品检验工培训

大肠菌群MPN法计数法操作程序流程

大肠菌群计数(MPN计数法)作业指导书

1.0 目的

规定大肠菌群计数的方法。

2.0 适用范围

适用于产品中的大肠杆菌群的计数。

3.0 术语

3.1 大肠菌群:在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

3.2 MPN最可能数:基于泊松分布的一种间接计数方法。

4.0 检验原理

MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

5.0 作业流程图

见附录A。

6.0 内容及要求

6.1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下:

6.1.1 恒温培养箱:36℃±1℃

6.1.2 恒温水浴箱:46℃±1℃

6.1.3 天平:感量0.1g

6.1.4 均质器

6.1.5 无菌吸管:1ml(具0.01刻度)、10ml(具0.1刻度)或微量移液器及吸头。

6.1.6 无菌锥形瓶:容量500ml

6.1.7 无菌试管:16mm×160mm、18mm×180mm

6.1.8 无菌玻璃珠:直径约5mm

6.1.9 无菌倒管

6.1.10 精密PH试纸

6.2 培养基和试剂

6.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

6.2.2 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

6.2.3 1mol/LNaOH 溶液:称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。

6.2.4 1mol/L HCl溶液:移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。

6.2.5 75%乙醇溶液

6.2.6 无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

6.3 操作步骤

6.3.1样品稀释

a、 固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1-2min,制成1:10的样品匀液。

b、 液体样品:以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。

c、 样品匀液的pH 应在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节。

d、 1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

e、 根据对样品污染状况的分析,按上述操作,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用一支1ml无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

6.3.2初发酵试验

a、 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1ml。

b、 将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

6.3.3复发酵试验(证实试验)

用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

6.3.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告

   6.3.3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN 值。

 

附录A

大肠菌群MPN计数检验程序

附录B

大肠菌群最可能数(MPN)检索表

每克(或每毫升)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见下表:

阳性管数

MPN

95%可信限

阳性管数

MPN

95%可信限

0.1

0.01

0.001

下限

上限

0.1

0.01

0.001

下限

上限

0

0

0

<3.0

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

>1100

420

注1:本表采用3个稀释度[0.1g(或0.1ml)、0.01g(或0.01ml)和0.001g(或0.001ml)],每个稀释度接种3管。
注2:表内所列检样量如改用1g(或1ml)、0.1g(或0.1ml)和0.01g(或0.01ml)时,表内数字应相应降低10倍,如改用0.01g(或0.01ml)、0.001g(或0.001ml)、0.0001g(或0.0001ml)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。


参照:
GB4789.3—2016

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