一、实验目的要求
1、 了解食品的质量与沙门氏菌检验的意义。
2、 掌握沙门氏菌的生物学特性。
3、 掌握沙门氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、 掌握沙门氏菌属血清学试方法。
5、 掌握食品中沙门氏菌检验的方法和技术。
二、原理
沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。
食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性平板分离沙门氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。
三、试剂和仪器
（一）最先准备的器材
规格名称 数量 用途
1、500ml广口瓶 1个 稀释样品
2、500ml三角瓶 1个 制缓冲蛋白胨水
3、250ml三角瓶 8个 制增菌液、培养基
4、15×150mm试管 18支 制三糖铁培养基和PH7.2尿素
5、13×130mm试管 30支 制蛋白胨水等
6、1ml移液管 5支
7、10ml移液管 2 支
8、直径为90 mm平皿 12套 制BS、SS平板
9、250ml量筒 1支
（二）应灭菌的其它器材
剪刀1把 不锈钢汤匙1把 称量纸适量
（三）应准备的培养基和试剂
培养基总量 所用容器
- 缓冲蛋白胨水(BP)： 1瓶 225ml/瓶 500ml三角瓶
- 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液： 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶
- 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液： 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶
- 亚硫酸铋琼脂(BS)： 4皿 1瓶 60ml/瓶 250ml三角瓶
- SS琼脂： 6皿 1瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶
- 三糖铁琼脂： 6支 6ml/支 40 ml 15×150mm试管
- 尿素琼脂(pH7.2)： 6支 4ml/支 25 ml 15×150mm试管
- 蛋白胨水： 6支 2ml/支 20 ml 13×100mm试管
- 氰化钾(KCN)培养基： 6支 4ml/支 30 ml 13×130mm试管
- 氨基酸脱羧酶试验培养基（赖氨酸）：6支 1ml/支 10 ml 13×130mm试管
- 氨基酸脱羧酶试验培养基（不含赖氨酸）：6支 1ml/支 10 ml 13×130mm试管
- 沙门氏菌因子血清：多价血清；11种因子血清。按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。
四、实验内容
样品处理→→前增菌→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告
第一天 样品处理和增菌培养
（一）样品处理
1、加工过的样品：
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。称取检样25g，加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，备用。
2、未加工样品：
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，备用。
（二）、前增菌和增菌
1、加工过的样品：
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。
l 接种操作：将混均匀的稀释样液放在36±1℃培养4h(干蛋品培养18～24h)；移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液（SC）内。
l 培养：于36±1℃培养18～24h。
2、未加工样品：
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。
l 接种操作：取25mL匀液，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）内
l 培养操作：于36±1℃培养18～24h。
第二天 接种选择性平板进行分离培养
（一）分离培养
l 接种操作：取前天增菌培养的增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板（BS）和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。
l 培养操作：于36±1℃分别培养18～24h(DHL、HE、WS、SS)或40～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。
第三天 观察分离结果，从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验培养基
(一)、观察分离结果
典型的沙门氏菌菌落形态如下：
A、在HEKTOEN氏肠道菌（HE）琼脂上。
菌落呈兰绿至兰色，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。
B、亚硫酸铋（BS）琼脂上。
产硫化氢的菌落为黑色，有时带有金属光泽，呈褐色，灰色或黑色。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。
C、SS琼脂上：
无色半透明；产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色。
（二）、五项生化试验
l 接种操作：
1、接种三糖铁琼脂：从选择性琼脂平板上，直接挑取2个或更多个菌落，分别接种三糖铁琼脂。用一空白培养基作对照试验。
用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种TSI斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。不需灼烧接种针，接种后面四项生化培养基。
2、接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验。各用一空白培养基作对照试验。
接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管。
l 培养操作：于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h。
l 革兰氏染色与镜检：从平板上挑取可疑菌落进行革兰氏染色与镜检
第四天 观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性，做血清学试验
（一）、观察五项生化试验结果
1、在三糖铁琼脂内，符合沙门氏菌属种的反应结果见表1。
表1 沙门氏菌属种在三糖铁琼脂内的反应结果
| 斜面 | 底层 | 产气 | 产硫化氢 | 可疑为沙门氏菌属和种 |
| - | + | +/- | + | 沙门氏菌属 |
| + | + | +/- | + | 沙门氏菌Ⅱ |
| - | + | + | - | 沙门氏菌属 |
| - | + | - | - | 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌 |
在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。
2、符合沙门氏菌属的五项生化试
按表2判定结果，沙门氏菌属五项生化试的结果应符合A1、A2和B1，其他反应结果均可以排除。
表2 沙门氏菌属种生化反应初步鉴别表
| 反应序号 | H2S | 靛基质 | 尿素(pH7.2) | 氰化钾(KCN) | 赖氨酸脱羧酶 | 判定菌属 |
| A1 | + | - | - | - | + | 沙门氏菌属 |
| A2 | + | + | - | - | + | 沙门氏菌属（少见） |
| B1 | - | - | - | - | + | 沙门氏菌属、甲型号副伤寒沙门氏菌属 |
| - | - | - | - | - |
符合反应序号A1，为沙门氏菌属典型反应，判定为沙门氏菌属细菌。如尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验三项中，有一项异常，按表3可判定沙门氏菌：
表3
| 尿素(pH7.2) | 氰化钾(KCN) | 赖氨酸脱羧酶 | 判定菌属 |
| - | - | - | 甲型号副伤寒沙门氏菌 |
| - | + | + | 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ |
| + | - | + | 沙门氏菌个别变体、 |
（二）、血清学分型鉴定
1、抗原的准备
一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%一3%)培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。
2、O抗原的鉴定
操作：用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
玻片凝集试验图
被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：
O 多价 1 A，B，C，D，E，F群(并包括6，14群)
O 多价 2 13，16，17，18，21群
O 多价 3 28，30，35，38，39群
O 多价 4 40，41，42，43群
O 多价 5 44，45，47，48群
O 多价 6 50，51，52，53群
O 多价 7 55，56，57，58群
O 多价 8 59，60，61，62群
O 多价 9 63，65，66，67群