二异丙基乙基胺—DIEA

环肽的合成方法

1.1.3五氟苯酚酯法：
　　这类活泼酯用于环肽的合成是近年才发展起来的。Joullie在合成天然环肽生物碱Sanjoinine G1和其C11位对映异构体时在环合步骤中就应用了五氟苯酚酯法。首先以D-丝氨酸为原料，经多步反应得到环合前体，用五氟苯酚活化羧基，N端苄氧羰基经氢解脱掉后，以4-吡咯烷吡啶为催化剂，在二氧六环中回流，最终得到两个互为异构体的混合物，收率分别为27%和22%[29-30]，环合步骤如下图

　　另外，海洋生物环肽Patellamine B以及对纤维蛋白酶和丝氨酸蛋白酶有强烈抑制作用的环肽Cyclotheonamide A 的环合步骤也是应用了五氟苯酯法，收率分别是20%和53%[31]。
1.2 迭氮法

　　在多肽合成中迭氮法是另一种比较经典的方法，这种方法的优点在于很少引起消旋反应，最早用于直链肽的合成，现在常常被用于环肽的合成[32-34]。具体方法是，把直链肽的甲酯，乙酯，苄酯，取代苄酯或其它更活泼的酯通过肼解的方式生成酰肼，溶于醋酸或盐酸-醋酸混合溶液，在-5°C左右的温度下加入1M的亚硝酸钠溶液，产生的亚硝酸则与酰肼反应生成迭氮物。N端游离的直链肽迭氮物于4°C 搅拌一天再升温至室温，可得环肽。通式如Scheme 4
　　　　Scheme 4. Peptide Cyclization via the acyl azide（X=Z or Boc，R=Me，Et，Bzl）
　　Bodansky最早应用迭氮法合成了cyclo(D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile)，虽然上述环肽不具有其母体化合物malformin的生物活性，但合成它为应用迭氮法合成环肽开辟了前景[35]。
　　应用迭氮法合成环肽的另一个成功的例子是内皮素拮抗剂的合成。Endothelin(ET)是一种高效的血管收缩剂，由21个氨基酸残基组成[36]，其受体拮抗剂之一cyclo(D-Trp-D-Asp(OtBu)Fmoc-Ser-D-Val-Leu)的合成过程[37]如下：

　　DPPA系二苯基磷酰基迭氮化物，是一种稳定的液体，沸点157°C，用二苯基磷酰氯和NaN3在丙酮中室温反应很方便地得到，可以直接用作多肽偶联的缩合剂[38]，近年来多用于环肽的合成[39-41]。
　　Arg-Gly-Asp（RGD）是多种细胞外蛋白与整合素相互作用时被整合素识别的关键序列，对含有该序列环肽的合成报道很多[42-45]。Kessler等用固相合成仪SP650合成了13个含RGD序列的线性六肽和七个含RGD序列的线性五肽，N端和C端均游离的直链肽在稀溶液中以DPPA为缩合剂，保持pH 8.5~9，反应4天，得到相应的环六肽和环五肽，收率在15%~50%之间。生物活性实验表明所有的环六肽对细胞粘附的抑制作用均明显低于线性肽GRGDS。环五肽中也只有Cyclo(RGDdFV)和Cyclo(RGDFd-V)对Laminin P1的细胞粘附具有明显的抑制作用[46-48]。
　　对于某些在碱性条件下易分解的目的物，反应过程当中应用惰性气体进行保护，例如，线性多肽H-Asp(Fmoc)- d-Ser-Phe- D-Phe- Arg- Gly – OH在无水DMF中，加入5倍量NaHCO3和10倍量DPPA，反应66小时，得到收率仅为3%的纤维蛋白原受体拮抗剂Cyclo(Asp-D-Ser- Phe-D-Phe-Arg-Gly);若改变NaHCO3和DPPA用量，并且反应过程中用氩气保护，反应三天，可得到产率高达39%的上述环肽.两种条件下所得收率有如此大的差别，主要原因是目的物在碱性条件下易分解[40]。
　　以DPPA为缩合剂合成环肽时，除了用NaHCO3、Na2CO3为无机碱外，也常使用KH2PO4。例如能够与鸦片受体结合的环肽Try-C[D-A2bu-Phe-Phe-(L or D)-Leu]的合成中，就使用了KH2PO4这样的弱碱催化，收率高达75%[49-50]。用同样的方法合成Somatostatin的类似物Cyclo(Lys-Phe-D-Trp-Lys-Thy-Phe)，收率也达到了42%[51]。
以DPPA为缩合剂合成环肽时，有机碱常用三乙胺[52]（Et3N）、N-甲基吗啉（NMM）和二异丙基乙胺（DIEA），这三种弱碱能够与有机溶剂混溶，用量远远少于NaHCO3和KH2PO4，而且NMM和DIEA不易引起消旋。

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