第一节  分光光度法

一、基本原理

光线是高速运动的光子流，也是具有波长和频率特征的电磁波。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。肉眼可见的光线称为可见光。可见光只占电磁波谱的很窄部分(400nm到760nm)。不同波长的可见光具有不同的颜色。波长大于760nm的光线称为红外线。波长小于400nm的光线称为紫外线。

当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。例如核黄素之所以呈现黄色，是由于它仅吸收可见光中的蓝光范围，并测得其吸收峰在450nm（图1-3）。在紫外光范围它还有两个吸收峰。它们分别是260nm和370nm。

分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。

 （核黄素22mmol/L溶于0.1mol/L  磷酸钠中，pH7.06，吸收杯厚1cm）

（一）郎伯定律(Lambert’s Laws)

一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著(图1-4)

若I₀表示入射光强度，I表示光线通过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。

则		－d I	＝αI, 　　－			d I	＝αI,  或		d I	＝αd L
		d L				d L			I
	积分：∫			d I	＝－∫αd L
				I

得：InI=－αL＋C       当Ｉ=0时，I=I₀，所以C=InI₀    即  InI=－αL＋InI₀

所以    In	I0	＝αL      或	I	＝e-αL
	I		I0
或   Log	I0	＝K1L     (K=	α	),	I	＝10-K1L
	I		2.303		I0

K₁是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液浓度影响。从上述公式可知，透过溶液后，光强度的减弱（I/I₀）与溶液厚度（L）呈指数函数关系。可见光强度的改变与溶液厚度并不呈简单的正比关系。这一关系就是郎伯定律。

 （二）比尔定律(Beer’s Law)

当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度减弱也愈显著，与上定律相似。两者的关系可以表示如下：

Log	I0	＝K2C,  或	I	=10-K2C
	I		I0

其中，C表示溶液的浓度。K₂是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液厚度的影响。上述公式所表示的光强度与溶液浓度的关系称为比尔定律。

虽然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比尔定律。这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。常见的原因如下：

    1．有些有色物质在溶液中可能解离成相应的离子，离子的颜色与分子的颜色不同，造成对比尔定律的误差。

2．有些物质在较高浓度状态下可形成络合物，络合物使吸收光谱发生改变。例如：氯化钴在稀溶液中呈玫瑰色，而在浓溶液中呈蓝色。

CoCl₂ + CoCl₂→Co²⁺ (CoCl₄)^2-

玫瑰色         蓝色

3．氢离子浓度和电解质也可引起一些有色物质颜色的改变，这些改变也可能造成比尔定律的误差。

（三）郎伯——比尔定律及其应用

Log	I	＝-KCL  或	I	=10-KCL
	Io		Io

一般将通过溶液后的光线强度（I）和入射光（Io）的比值称为透光度(transmittance, T)，将-Log  用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映该溶液对光吸收的情况。有时也用吸光度(absorbance, A)表示。则它们之间的关系如下

A（D）=－Log	I	＝－LogＴ ＝ＥＣＬ     ……(1)
	Io

其中，Ｅ为消光系数(Extinction coefficient), 表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。

从公式（1）可知对于相同物质和相同波长的单色光（消光系数不变）来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。

	D1	＝	C1	或写作   C1=	D1	×C2  (2)
	D2		C2		D2

如果C₂为标准溶液的浓度，则可根据测得的光密度值，按公式（2）求得待测溶液的浓度。

实际工作中为简便起见，常常不是每测一个待测样品都做一个标准管，而是事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以光密度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的光密度后，便可从标准曲线上查到相应的浓度数值。

从公式（1）可知，若知道某待测物质的消光系数和溶液的厚度，也可以从光密度推算出待测溶液的浓度。消光系数的常用表示方法有二：

1．百分消光系数（E^1%_1cm）；浓度以百分浓度来表示的消光系数。百分消光系数等于浓度为1%，液层厚度为1cm的光密度值。

2．克分子消光系数（ε）；浓度以摩尔浓度来表示的消光系数。克分子消光系数等于溶液浓度为1个摩尔浓度，液层厚度为1cm的光密度值。

用消光系数计算浓度的公式是： 

C=	D	(浓度单位为g/100ml)  或C=	D	(浓度单位为摩尔浓度)
	E1%1cm		ε

例：一蛋白质溶液在其吸收峰λ=278nm处的光密度D=0.520，吸收杯厚度为1.00cm，已知E^1%_1cm278=5.10，则此蛋白质溶液的浓度为 

C=	D	＝	0.502	=0.102%
	E1%1cm		5.10

 二、分光光度计的结构原理

不论光度计(Photometers)、比色计（Colorimenters）还是分光光度计(Spectrophoto- meters)，其基本结构原理都是相似的，都由光源、单色光器、狭缝、吸收杯和检测器系统等部分组成（图1-5）。

（一）光源

一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。几乎所有的光度计都采用稳压调控的钨灯(tungsten lamp)。它适用于做340-900nm范围的光源。更先进的分光光度计外加有稳压调控的氢灯(hydrogen lamp)。它适用于做200 -360nm的紫外分光分析的光源。

（二）单色光器

分光光度法测定某一物质的光密度需要在某一特定波长下进行。单色光器的作用在于根据需要选择一定波长范围的单色光。在实际工作中欲选择出单个某波长的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量较少而言。单色光的波长范围愈窄，仪器的敏感度愈高，测量的结果愈可靠。

最简单的单色光器是光电比色计上所采用的滤光片（一定颜色的玻璃片）。由于通过光线的光谱范围较宽，所以光电比色计的分辨效果较差，但对比色分析还是可以得到较为满意的效果的。棱镜(Prism)的衍射光栅(diffraction grating)是较好的单色光器。它们能在较宽光谱范围内分离出相对单一波长的光线（图1-6）。

（三）狭缝

通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能过弱不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通路上形成的狭缝。通过调节狭缝的大小来调节入射单色光强度并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。

（四）吸收杯

吸收杯又叫样品杯(Sample Cell)，是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光学玻璃吸收杯，在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。注意保护吸收杯的质量是取得好的分析结果的重要条件之一。不得用粗糙、坚硬物质接触吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光学面；用后要用水及时冲洗，不得残留测定液，尤其是蛋白质和核酸溶液。

（五）检测器系统

硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过吸收杯的光线（I）的能量转变成电能。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。

光电比色计用硒光电池为受光器。硒光电池的光敏感性低。它不能检出强度非常弱的光线。并且，对波长在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。

较精密的分光光度计都是采用真空光电管或光电倍增管作为受光器的，并采用放大装置以提高敏感度。虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的弱很多，但这种有放大线路的灵敏检测系统仍可能准确地检测出来。

三、几种常用的国产分光光度计

（一）721型分光光度计（图1-7）   

这是一种采用光电管为受光器的较高级可见光分光光度计。由稳压电源供电的光源灯发出稳定的白光。如图1-7所示。光线经反射镜投入狭缝，再经准直镜反射进入棱镜，在棱镜中发生色散后，光线经铝面反射后，其中一部分经原路返回，并穿过狭缝，透过反射镜进入吸收杯。从吸收杯射出的光线再经光门射到光电管上，产生相应的电流，并经电流表指示出相应的刻度值。

其中色散棱镜装在一个可以转动的圆盘上，旋转波长选择钮可使之发生偏转，使不同波长的光线通过狭缝形成一定波长的单色平行光线。同时，波长盘也随之转动以指示波长数字。此型分光光度计给出360~800nm范围的波长，在410-710nm之间灵敏、适用。使用方法如下（各调节部位参看图1-8）。

1．灵敏度选择钮放在“1”档（如调不到“0”时，再选用较高的档）。

2．转动波长选择钮，选用所需的波长。

3．接通电源（指示灯亮）。

4．揭开比色皿暗箱盖，转动“0”位钮，使电表指针对准T=0处。

5．将比色杯杯放入比色杯架上，使空白管对向光路，盖好比色皿暗箱盖，转动“百位钮”调准电表指针使之指向D=0（T=100处）。

6． 拉动比色皿座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值，记录。测读过程中，随时将拉杆推回到原位，使空白杯进入光路，并转动“百位钮”，使指针回到D=0处。

7． 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色皿暗箱盖盖好，清洗比色皿并空干。

8． 注意事项

（1）光电比色计属精密仪器，应精心爱护使用，要防震、防潮、防腐蚀。

（2）比色杯的好坏对光密度读数的影响很大，要保持比色杯的清洁干净，保护光学面的透明度，不能手握光学面，也不能用粗糙的物体接触光学面，比色杯中的液体应适量，不应过满，比色杯外壁的液体应用擦镜纸擦干，以防腐蚀仪器和影响读数。如比色液为强酸强碱，应尽快比色，以防破坏比色杯。

（3）比色时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳。如需连续使用，中间应适当暂停使用，使之避光休息。

（二）UV-754型分光光度计

这是一种可供在紫外到红外区（200-1000nm）测量吸收光谱的较高级分光光度计。此仪器的光学部分与721型分光光度计相类似，但它采用石英棱镜作单色光器，有钨丝灯和氢弧灯两种光源。754型分光光度计的电学部分较为复杂（图1-9）。光电流经过放大线路加以放大后，此时得到的样品信号变为与透光率成比例的值。其后，调零、变换对数、浓度计算、打印数据等均由微处理机进行。

仪器的使用方法

1．测试准备

（1）打开电源开关之前,检查一下试样室是否放置遮光物。

（2）试样槽置“参考”位置。

（3）接电源开关(如果波长工作在于200～360时需按氘灯触发按钮)。(参见图1-9)

显示器显示“754”后，数显而易见：“100.0”，则表示仪器已通过自检程序。

（4）仪器预热三十分钟后开始测试。

测试

（1）数显为100.0后，稳定2～3秒钟，即可把试样槽置“样品”位置进行测试。待第一个数据打印完毕后，再可将试样槽置第二个“样品”位置测试。

（2）每当需要调换波长时，必须把试样槽置“参考”位置，重新调满度。

[注意]：如果在幅度设定测试波长时，需等待数分钟后，才能工作，因这时光能量变化急剧，使光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间。

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