一、实验目的要求
1、 了解细菌总数检验的意义。
2、 掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法
3、 掌握国际法测定菌落总数的方法和技能
4、 掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能
5、 熟练无菌操作技术。
二、原理
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
三、试剂和仪器
细菌总数的检验部分：
（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）
规格名称 数量 用途
1、500ml广口瓶 1个 稀释样品
2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水
3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂
4、18×180mm试管 3支 稀释样品
5、1ml移液管 5 支
6、直径为90mm平皿 10套 倒营养平板
7、250ml量筒 1支
8、玻璃珠：直径约5mm
（二）应灭菌、消毒的器材
剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量
酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只， 开瓶器
（三）应制备的培养基
培养基总量 所用容器
1、 0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶
2、 营养琼脂： 2瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶
食品中霉菌和酵母菌的计数部分：
（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）
规格名称 数量 用途
1、500ml广口瓶 1个 稀释样品
2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水
3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂
4、18×180mm试管 3支 稀释样品
5、1ml移液管 ５ 支
6、10ml移液管 1支
6、直径为90mm平皿 10套 倒平板
7、250ml量筒 1支
8、玻璃珠：直径约5mm 适量
（二）应灭菌消毒的器材
剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量
酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只
（三）应制备的培养基
培养基总量 所用容器
- 灭菌蒸馏水： 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶
- 高盐察氏培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶
- 孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶
四、实验内容
细菌总数的检验部分：
（一）、基本操作过程：
样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。
（二）、样品的稀释（样品的处理）
样品：袋装乳粉
外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。
3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。
4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。
u 注意：
①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。
②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。
③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。
④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。
（三）、倒平板
稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。
u 注意：
①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。
（四）、培养
待琼胶凝固后，翻转平皿，置36±1℃温箱内培养48h后取出，立即计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
u 注意：
（1） 琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。
（2） 如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24 h。
l 不同产品菌落总数测定的培养时间：
肉、乳、蛋及制品： 37℃培养 48h
水产品： 30℃培养 48h：
清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：37℃培养 24h
食品中霉菌和酵母菌的计数部分：
（一）、基本操作过程：
样品称量→→样品的稀释→→倾注平皿→→培养5天→→计数报告。
（二）、样品的稀释（样品的处理）
样品：糕点、果脯、糖果类，或粮食类
外包装消毒→→无菌称取样品25g→→加无菌水→→加盖振荡、吹吸均匀
- 糕点：如为原包装，用灭菌镊子夹下包装纸，采取外部及中心部位。如为带馅糕点，取外皮及内馅25g,奶花糕点，采取奶花及糕点部分各一半共25g。
- 果脯：采取不同部位称取25g检样，加入灭菌水225mL，制成混悬液。
- 糖果：用灭菌镊子夹取包装纸,称取数块共25g，加入预温至45℃的灭菌水225mL，待溶化后检验。
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以无菌操作开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中。然后加入225mL的灭菌水，采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇30 min，振摇均匀，即为1:10的稀释液。
2、用10ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液10ml，注入无菌试管内，另用带橡皮乳头的1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
3、用1ml灭菌吸管，吸取上述1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌水的试管内，换一支1ml灭菌吸管反复吹吸5次，制成1∶100稀释液。
4、另取1ml灭菌吸管，吸取上述1∶100稀释液1ml，注入含有9ml灭水的试管内，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。
5、根据对检样污染的情况估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
6、用1ml无菌水作空白对照试验，做2个平皿。
u 注意：
①加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。
②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内紧贴。
③每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。
（三）、倒平板
稀释液移入平皿后，及时将凉至46℃的培养基（可放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并正反转动平皿使混合均匀。
u 注意：
①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜过长。
（四）、培养：
待琼脂凝固后，翻转平皿，置25～28℃温箱内培养5天，从第3天开始观察后取出，共观察培养5天。
（五）、菌落计数及报告：
选取菌落数10～150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。稀释度选择及菌落数报告方式可参考菌落总数测定的报告方式。
五、思考题
1、 食品检验为什么要测定细菌菌落总数？
2、 食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？
3、 为什么营养琼脂培养基在使用前要保持地（46±1）℃的温度？
4、 培养时为什么要把培养皿倒置培养？
5、 在菌落总数测定和霉菌、酵母菌的计数中，两者在样品处理过程中有何不同？列表说明？计数时又有何异同处？
6、 计数下表中的数值：
| 项目 | 例次 | 稀释度及菌落数 | 两稀释度菌落数之比 | 菌落总数/[cfu/g（mL）] | 报告方式/[cfu/g（mL）] | ||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | |||||
| 菌落总数测定 | 1 | 多不可计 | 120 | 25 | |||
| 2 | 多不可计 | 250 | 45 | ||||
| 3 | 多不可计 | 180 | 40 | ||||
| 4 | 多不可计 | 多不可计 | 320 | ||||
| 5 | 28 | 12 | 1 | ||||
| 6 | 0 | 0 | 0 | ||||
| 7 | 多不可计 | 310 | 15 | ||||
| 霉菌、酵母菌计数 | 8 | 多不可计 | 120 | 8 | |||
| 9 | 200 | 140 | 26 | ||||
| 10 | 180 | 120 | 25 | ||||
| 11 | 多不可计 | 多不可计 | 152 | ||||
| 12 | 0 | 0 | 0 | ||||
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