实验二 培养基的配制及器材的灭菌
一、实验目的要求
1、 进一步学习并熟练培养基的制备的方法、步骤和技术。
2、 进一步学习和掌握高压蒸汽灭菌的具体操作方法和技术。
3、 为下一次实验做好实验前的准备。
二、原理
培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，它是进行科学研究，生产微生物制品及应用等方面的基础。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需要不同，选择配制不同的培养基。
从培养基的用途来区分，培养基可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。
l 选择培养基 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。
l 增殖培养基 在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。
l 鉴别培养基 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。
有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。
灭菌原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121．3℃灭菌20分钟即可。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160—170℃），时间长（1—2小时）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。
三、试剂和仪器
1、 药品及试剂：：牛肉膏、酵母膏、乳糖、蛋白胨、猪胆盐、 琼脂、 MgSO4·7H2O FeSO4、NaCl 等
2、 仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱
3、 玻璃器材及其它：试管、三角瓶 、烧杯、量筒、玻棒、药匙、玻璃漏斗、pH试纸（5.5-9.0） 、棉花、牛皮纸、记号笔、棉线、纱布、吸管（1ml）、培养皿、玻璃珠。
四、实验内容
（一）、配制培养基
配制菌落总数测定、霉菌和酵母菌计数中的培养基，大肠菌群测定中的部分培养基：
营养琼脂、0.85%生理盐水，高盐蔡氏培养基、灭菌蒸馏水，乳糖胆盐发酵管等，具体内容见各个实验的培养基部分。
l 配制培养基的制备与分装
1、 称量 除琼脂外，按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入适当大小的烧杯中。蛋白胨极易吸水，称量时动作要快。补足所需水分，混匀后加入琼脂。
2、 加热溶解 向烧杯内加入所需水量的一部分，放到电炉上加热，同时不断进行搅拌，使其溶解，最后补足所需水分。加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。
3、 调pH值 用精密pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。
4、 加入琼脂融化 向溶液中加入所需的碎琼脂，在电炉上一面加热一面搅拌，直到琼脂完全融化后才能停止搅拌，并加入热水补足水分。
5、 过滤 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。没有悬浮物的不用过滤。
6、 分装 将培养基趁热加至漏斗上进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中，装试管时，装量不要超过试管的1/4；如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于三角瓶或锥形瓶内，一般以其容积的1/2为宜。注意管口不要沾上培养基。
在漏斗下口处套有一段透明胶管，胶管下部用弹簧夹夹紧。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
7、 加塞、包扎、标记 加上塞子，然后在外面用一层牛皮纸包扎。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。
分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞做成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，准备灭菌。
（二）、培养基及器材的灭菌
l 杀菌操作流程：
检查杀菌锅各部件是否正常→加水→装锅→加盖密封→通电加热→排空气（大量蒸汽排出时，维持5 min）→升温→恒温杀菌→断电降温→开盖→取出物品
u 培养基、无菌水等：放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。
1、 含糖培养基：115℃灭菌10min或113℃灭菌15min
2、 无糖培养基：121℃灭菌15～20min
u 玻璃器皿：干热灭菌，放入烘箱加热灭菌：160～165℃灭菌2h；或湿热灭菌：121℃灭菌20～30min。