生活饮用水中总大肠菌群验证报告

1. 检验标准： GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法微生物指标

2．验证项目：总大肠菌群

3. 试剂配制

3.1 乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨干粉培养基23g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装有倒立发酵管试管中，每管10mL，115℃，20min高压灭菌备用。

3.2 双料乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨干粉培养基46g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装有倒立发酵管试管中，每管10mL，115℃，20min高压灭菌备用。

3.3 伊红美蓝培养基：称取伊红美蓝培养基37.5g溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃，15min高压灭菌备用。

3.4 无菌生理盐水：称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中，121℃，15min高压灭菌备用。

3.5 革兰氏染色液

4．实验材料：

4.1 高压蒸汽灭菌器

4.2 培养箱36℃±1℃

4.3 冰箱

4.4 天平

4.5 显微镜

4.7 锥形瓶

4.8 灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等。

4.9 小倒管

4.10 载玻片

5．实验步骤：

5.1 验证用菌株及菌种要求

大肠埃希菌【ATCC 25922】验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代）。

5.2 验证样品制备

接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18～24小时。用0.85%无菌生理盐水制成每1mL含菌数为100～1000cfu的菌悬液，取10mL菌悬液加入到90mL灭菌水样中，作为检测样品原液。灭菌水样中含菌量为10～100cfu。

5.3  实验操作

5.3.1用1mL无菌吸管吸取验证样品1mL，延管壁缓缓注入9mL无菌生理盐水中，振摇试管使其混合均匀，制成1：10的样品菌液。

5.3.2取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，再取1mL 1：10的水样接种到单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。

5.3.3取15支乳糖蛋白胨培养管加入无菌生理盐水各1mL作为阴性对照管，36℃±1℃培养24±2h小时。

5.4  实验结果判断依据

乳糖蛋白胨培养管未产气产酸，判该管未检出总大肠菌群；若产酸产气，应取发酵管中的培养物一环分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，培养18～24h小时，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。

深紫黑色、具有金属光泽的菌落；

紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；

淡紫红色中心较深的菌落。

经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱中培养24±2h，有产酸产气者，即报告总大肠菌群阳性。

5.5  总大肠菌群最可能数的报告

根据总大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告每100毫升样品中总大肠菌群的MPN值。

5.6  总大肠菌群的记录及报告

备注  ＋代表乳糖蛋白胨产酸产气 －代表未乳糖蛋白胨未产酸产气

6. 再做两次独立的平行实验（重复步骤2），得到两组数据

7. 验证结果

在3次独立的平行试验中，试验组检出总大肠菌群阳性，阴性对照组总大肠菌群阴性。本次验证共进行三次，在相同的检验条件下，检验结果均符合规定。

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