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食品中大肠菌群测定流程操作规程

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大肠菌群测定操作流程(平板计数法)

7.1 大肠菌群

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

7.2 实验器材和材料

培养箱、水浴锅、均质器、天平、吸管、锥形瓶、培养皿、镊子、剪刀、试管、试管架等。

结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA);煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB);生理盐水等。

7.3 检验流程

 7.4 操作步骤

1.配制培养基:按照试剂瓶上的配制过程进行配制。

2.配制生理盐水:称取 8.5g 的氯化钠溶于 1000mL 蒸馏水中。

3.将需要的培养皿、吸管、三角瓶、试管进行加塞和包扎。

4.高压灭菌:121℃灭菌 15-20min。

加水-装料-加盖-排气-升压-保压-降压-无菌检查

5.将所有检验需要用到的物品放入超净工作台上,开紫外灯杀30min,关闭紫外灯,打开日光灯和风机。

6.样品稀释:

(1)糕点(饼干)、面包:超净工作台上打开包装,如为原包装,用灭菌镊子夹下包装纸,采取外部及中心部位。如为带馅糕点,取外皮及内

25g,裱花糕点,采取奶花及糕点部分各一半共 25g,加入 225 mL 无菌生理盐水中,制成制成 1:10  的样品匀液。

(2)用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10  样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制 1:100  的样品匀液。同样的方法,制备 1:1000 的样品均液。

(3)样品匀液的 pH 值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/LNaOH 或 1 mol/L HCl  调节。

7、加样:

(1)根据对样品污染状况的估计,选择 2  个~个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行 10 倍递增稀释时,吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

(2)及时将 15 mL~20 mL 冷至 46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加 3 mL~4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。

8、平板菌落数的选择选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm或更大。

9、证实试验

VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB  肉汤管内,36 ℃±1 ℃培养 24 h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

7.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每 g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4 样品稀释 1 mL,在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落,挑取其中 10 个接种BGLB 肉汤管,证实有 6 个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。

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