食品微生物细菌革兰氏染色

 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的

 

图2-2-3 革兰氏阳性菌、阴性菌结构

 革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁成分比较

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、产气荚膜梭菌、粪链球菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定。

1.菌种

（1）大肠杆菌（Escherichia  coli)斜面菌种1支

（2）枯草杆菌（Bacillus  subtilis)斜面菌种1支

2.仪器

普通光学显微镜

3.染色液

（1）结晶紫染色液

结晶紫              1g

95％乙醇             20mL

1％草酸铵水溶液      80mL

将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

 （2）革兰氏典液

碘                 1g

碘化钾             2g

蒸馏水              300mL

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

番茄花红复染液

（3）番茄花红复染液

番茄花红            0.25g

95％乙醇             10mL

蒸馏水               90mL

将番茄花红溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

4.其他材料

载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水、擦镜纸、吸水纸、香柏油、清洁剂等

【任务实施】

1.无菌取样

图2-2-1 无菌取样技术

图2-2-2 简单制片流程

图2-2-4 革兰氏染色流程

制片——固定——初染（结晶紫染液）1-2min——水洗——媒染（碘液）1min——水洗——脱色（95％乙醇至无色）——水洗——复染（番红染液）1-2min——水洗——干燥——镜检

 

2.操作说明

（1）涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm²。

（2）干燥：室温自然干燥。

（3）固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2～3次。此操作也称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在玻片上。

（4）涂片

① 常规涂片法

取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

② “三区”涂片法

在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。

（5）初染

滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。

（6）媒染

用卢戈氏碘液媒染约lmin，水洗。

（7）脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。

（8）复染

在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。

（9）镜检

干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G⁺），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G^-）。

（10）实验结束后处理

清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。

 

【归纳总结】

1.结果记录

 革兰氏染色结果记录

 

2.注意事项

（1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。

（2）乙醇脱色时间是革兰氏染色成败的关键，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌。如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。

（3）应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。

（4）火焰固定不宜过热。

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